近年來，全球化妝品行業(yè)高速蓬勃發(fā)展，不斷涌現(xiàn)的創(chuàng)新技術(shù)與前沿方法持續(xù)引領(lǐng)著化妝品原料與配方的革新，成分更復雜、功能更多樣化的新產(chǎn)品應運而生。這些變化不僅極大地豐富了市場供應，同時也對相關(guān)產(chǎn)品的檢測與監(jiān)管工作提出了新的要求?；瘖y品安全性和功效性檢測的重要性不言而喻。因此，為積極響應我國“兩品一械”（涵蓋藥品、化妝品及醫(yī)療器械）新法規(guī)的全面落實，并緊跟全球化妝品產(chǎn)業(yè)最新動態(tài)，研發(fā)并推出更加嚴謹、高效的化妝品原料評價方法已成為當務之急。
已知皮膚是我們?nèi)梭w最大的器官，由表皮、真皮和皮下組織三部分構(gòu)成。作為保護人體的第一道防線，皮膚經(jīng)常直接接觸多種化學和生物物質(zhì)，包括化妝品、紫外線、病原體、環(huán)境污染物、微生物和洗滌劑等，從而引發(fā)如炎癥、過敏反應、衰老和癌癥等問題。因此，為評估某些原料的安全性或檢測化妝品的功效性，需要進行皮膚測試。
圖1 皮膚衰老的相關(guān)作用機制（圖片來源網(wǎng)絡）
此前，通常借助動物皮膚代替人體皮膚進行實驗。2019年，美國環(huán)境保護局宣布將從2035年開始停止支持使用哺乳動物進行安全性測試的研究。隨著“3Rs原則”（reduction，replacement，refinement）的提出，越來越多的國家考慮到動物福利，倡導盡量減少動物實驗。而且小鼠與人體皮膚厚度和毛發(fā)均存在明顯差異，除腳墊之外沒有汗腺。因此，開發(fā)穩(wěn)定、能夠模擬人類的體外皮膚模型以替代化妝品行業(yè)中傳統(tǒng)的動物實驗變得尤為重要。
體外皮膚模型的發(fā)展始于20世紀40年代，最初的嘗試源于對成年哺乳動物皮膚上皮的體外培養(yǎng)。1975年，科學家們開發(fā)出了使用成纖維細胞的二維皮膚模型；隨后的第二年，首個三維皮膚模型問世，這一模型更接近真實皮膚的結(jié)構(gòu)和功能。自那以后，研究者們陸續(xù)開發(fā)出多種類型的人類皮膚等效物，這些模型被廣泛用于評估化妝品的安全性和功效性，有效推動了化妝品行業(yè)的科技進步和動物福利的提升。
其中，人體體外皮膚模型的發(fā)展可以概括為幾個具有代表性的階段：二維皮膚模型（2D細胞培養(yǎng)）、三維皮膚模型、皮膚類器官（Organoids）、器官芯片（Organs-on-chips，OOC）、3D生物打印、傳統(tǒng)皮膚芯片（skin-on-chip，SoC）和新型皮膚芯片。
2D細胞培養(yǎng)一直是培養(yǎng)細胞的常用方法，這種模型主要涉及在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)皮膚細胞，操作簡單，成本較低，便于觀察細胞行為和進行基礎(chǔ)的毒理學實驗，但不能模擬皮膚的三維結(jié)構(gòu)，且缺乏細胞-細胞或細胞-基質(zhì)之間的交流相互作用，因此生理相關(guān)性較低。
在2D細胞基礎(chǔ)上，三維皮膚模型將細胞、細胞生長因子、再造基質(zhì)蛋白以及適合的骨架混合在一個體系中進行共同培養(yǎng)，更貼近真實的皮膚結(jié)構(gòu)，能夠模擬表皮和真皮層的相互作用，提高了模型的生理相關(guān)性。但三維皮膚模型缺乏血管系統(tǒng)，易出現(xiàn)營養(yǎng)和代謝物交換受限、藥物滲透和分布不真實、炎癥和免疫反應模擬不足及修復再生能力有限等缺點。
類器官（Organoids）和器官芯片（Organ-on-a-chip）是兩種先進的生物模型，用于研究人體器官的功能、疾病發(fā)展以及藥物測試，但其構(gòu)建和應用方式有所不同。
類器官是一種三維細胞結(jié)構(gòu)，由來源于干細胞或器官特定干細胞的細胞在體外培養(yǎng)而成，能夠模擬真實器官的微觀結(jié)構(gòu)和功能。類器官廣泛應用于疾病建模、生理功能研究和藥物篩選等領(lǐng)域。但可能缺乏完整的血管系統(tǒng)，難以完全再現(xiàn)器官的所有生理和病理功能。
圖2 構(gòu)建皮膚類器官的主要細胞來源（圖片來源網(wǎng)絡）
器官芯片是一種微流控芯片，通過在微型芯片上構(gòu)建生物活性的微型環(huán)境來模擬人體器官的生理和機械功能。芯片通常由透明聚合物制成，內(nèi)部含有微型通道，可以流動細胞和培養(yǎng)基，模擬血液流動等生理條件，精確控制細胞環(huán)境和外部物理條件，如流體力學和機械壓力。然而，器官芯片雖然可以模擬單個或多個器官的相互作用，但構(gòu)建復雜的多器官系統(tǒng)仍具挑戰(zhàn)性。
圖3 不同細胞構(gòu)建的器官芯片
3D生物打印將3D打印與生物醫(yī)學結(jié)合起來，利用醫(yī)學成像技術(shù)如核磁共振或斷層掃描獲得三維數(shù)據(jù)，活細胞和生物材料作為“生物墨水”，層層精確堆砌得到3D結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)模型相比，3D生物打印顯示出更高的靈活性、可重復性、分辨率以及能夠進行大規(guī)模培養(yǎng)的能力。但該模型同樣因缺乏血管系統(tǒng)存在部分缺點。
微流控皮膚芯片是一種利用微流控技術(shù)模擬人體皮膚結(jié)構(gòu)和功能的實驗平臺。這種芯片包含微小的流道和腔室，可以通過控制參數(shù)如培養(yǎng)基流動、機械力、生物化學物質(zhì)的濃度梯度等模擬真實人體皮膚的三維培養(yǎng)微環(huán)境。精確控制流體的流動和環(huán)境條件，我們就可以在芯片上培養(yǎng)皮膚細胞，研究細胞間的相互作用、藥物輸送和病理狀態(tài)。微流控皮膚芯片應用范圍廣泛，包括藥物篩選、毒理學測試、疾病模型研究以及化妝品安全和功效評估等。這種技術(shù)通過減少對動物實驗的依賴，不僅提高了實驗的倫理性，還能提供更精確、更具人體相關(guān)性的研究結(jié)果。
圖4 微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖
皮膚芯片目前主要有兩種制作思路：
- 轉(zhuǎn)移皮膚芯片：將供體的皮膚活檢或人體皮膚等效物（human skin equivalents，HSEs）引入微流控系統(tǒng)，通過系統(tǒng)下方培養(yǎng)基動態(tài)培養(yǎng)。這類芯片直接采用供體的皮膚樣本，操作簡便，但個體差異和體外存活問題不容忽視。
- 原位皮膚芯片：在微流控系統(tǒng)內(nèi)部直接培養(yǎng)成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞等，以此形成皮膚模型。該法通過統(tǒng)一的細胞培養(yǎng)減少了來自不同供體的個體差異和對供體皮膚的損傷，但培養(yǎng)周期較長，成本高，所生成的皮膚模型與真實人體皮膚之間仍存在一定差異，仍需不斷改進。
圖5 皮膚芯片側(cè)視圖
此外，根據(jù)制備材料的不同，皮膚芯片被分為多種類型，我們將在后續(xù)推文中進行詳細介紹，今天一起來看看新型微流控皮膚芯片在化妝品安全和功效評價中的應用吧！
化學刺激評估
微流控皮膚芯片在安全性評估中主要作用于皮膚致敏性和刺激性試驗的毒理學評價。
Jong Seung Lee 等構(gòu)建了一種皮膚-神經(jīng)和皮膚-肝臟復合模型人體皮膚芯片，該芯片結(jié)合了鈣成像以監(jiān)測神經(jīng)元活性、GSH/ROS分析評估肝臟毒性的分析技術(shù)，可實時定量分析皮膚對化學物質(zhì)的致敏性及化學物質(zhì)的潛在肝毒性，達到精確評估化學物質(zhì)對皮膚毒理學影響的目的。
Jing Zhang 等通過在微流控系統(tǒng)中直接培養(yǎng)和分化人類角質(zhì)形成細胞構(gòu)建出一款高度仿真表皮芯片，并對10種已知的毒性和非毒性物質(zhì)進行體外細胞毒性刺激測試，深入分析評估炎癥因子的釋放。該皮膚芯片可以作為體外皮膚刺激評估的有效替代工具。
圖6（a）混合皮膚模型單元設(shè)計和六單元并聯(lián)全芯片；（b）高仿真表皮芯片結(jié)構(gòu)
Mc Cormick 等利用微流控技術(shù)和可透過紫外線（UV）的石英基底裝置構(gòu)建暴露于多種不同外部條件的多通道皮膚芯片，測定單參數(shù)暴露（UV或納米二氧化鈦）和多參數(shù)暴露（UV和不同濃度的納米二氧化鈦）下人表皮細胞（HaCaT）的毒性反應。
圖7 不同紫外線曝光方法的圖示：（a）生物安全柜頂部向下的紫外線照射96孔板；（b）光臺底部向上的紫外線照射微流控芯片；（c）為孔板照片；（d）為微流控設(shè)備照片
有效成分篩選
化妝品開發(fā)過程中，有效活性成分的篩選需要花費大量時間，微流控平臺的開發(fā)能夠有效提升篩選效率。Chen 等在芯片上培養(yǎng)真皮成纖維細胞球體（dermal fibroblast sphere，DFS），而后將不同濃度的維生素C加入微室，探究其對DFS產(chǎn)生I型膠原蛋白和纖維連接蛋白的影響。該方法能夠在3天內(nèi)高效地篩選出維生素C對蛋白質(zhì)合成的作用。此外，該芯片能夠?qū)?2種不同的成分或組合進行高通量篩選，極大地縮短了化妝品的研發(fā)周期。
圖8 支持真皮成纖維細胞球培養(yǎng)的四聯(lián)體芯片
透皮吸收
透皮吸收實驗可以測試化妝品中活性成分能否有效穿透皮膚并達到預期的皮膚層，從而發(fā)揮作用效果，包括在體內(nèi)的積累情況及可能的副作用，對于證明產(chǎn)品的功效聲明、確保成分安全至關(guān)重要。Franz擴散池法是目前最常用的透皮吸收測試方法，它使用雙室系統(tǒng)，一室裝有待測試化妝品，另一室裝有接收介質(zhì)。兩室之間通過皮膚（可以是動物皮膚或人體皮膚）隔開。測量從供給室通過皮膚到接收室的活性成分遷移量，評估待測物的透皮吸收能力。
但Franz擴散池法不能模擬皮膚的生理環(huán)境，如血液供應和代謝活動，導致實驗數(shù)據(jù)與實際情況出現(xiàn)偏差。且動物皮膚與人類皮膚在結(jié)構(gòu)和功能上存在差異，可能涉及倫理問題。采用皮膚芯片不僅可以避免倫理問題和物種間差異，還能更有效地模擬皮膚微循環(huán)，多通道系統(tǒng)允許同時多個樣品的測試，大大提高實驗效率和準確度。
Bajza等所開發(fā)的基于聚二甲基硅氧烷的微流控芯片可用于局部化妝品經(jīng)皮吸收的體外/離體監(jiān)測，并可以根據(jù)具體需求部分改裝。實驗研究了兩種P-糖蛋白底物模型藥物（奎尼丁和紅霉素）在糖蛋白抑制劑存在和不存在條件下的透皮吸收曲線。結(jié)果表明，P-糖蛋白在皮膚中具有吸收方向性，局部抑制劑可改變其作用。該微流控擴散室能夠用于探究皮膚芯片微流控系統(tǒng)與透皮成分傳遞及真皮屏障中轉(zhuǎn)運蛋白之間的交互作用，在評估化妝品透皮吸收方面具有重要應用潛力。
圖9 “皮膚芯片”微流控擴散池結(jié)構(gòu)示意圖
抗衰功效評估
隨著社會進步和人們生活水平的提高，皮膚抗衰領(lǐng)域近年來取得了顯著發(fā)展?？顾ヒ庾R逐漸深入人心，護膚品市場不斷細分，針對不同膚質(zhì)、不同年齡及不同部位抗衰需求的護膚品層出不窮。人們希望通過使用化妝品來減緩皮膚老化進程，維持皮膚健康和年輕態(tài)，關(guān)于抗衰的研究也在持續(xù)進行。
Kim 等研發(fā)出一種模擬人體皮膚結(jié)構(gòu)和功能的“無泵皮膚芯片”用于化妝品測試。該模型是利用人原代成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞構(gòu)建的由真皮和表皮組成的皮膚等效模型。利用重力流裝置將介質(zhì)以兩邊15°的角度旋轉(zhuǎn)，使其通過無泵的片上皮膚微流控通道循環(huán)流動。使用天然產(chǎn)物化妝品成分姜黃葉提取物進行測試，評估該成分的功效。研究發(fā)現(xiàn)，皮膚表皮層的屏障功能增強，從而表現(xiàn)出抗衰老作用。
圖10 微流控芯片裝置示意圖
β-半乳糖苷酶是一種通常用于監(jiān)測衰老的生物標志物，其表達隨細胞衰老程度的加劇而升高。Subin Jeong 等通過構(gòu)建基于人類成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞的全層三維柔性皮膚芯片，使用光交聯(lián)劑和周期性機械刺激加速全層皮膚老化，復制28天晝夜節(jié)律。在28天對比培養(yǎng)實驗中，觀察到全層皮膚模型的收縮和表皮層厚度均有所減少，同時β-半乳糖苷酶基因表達增加，詳細記錄了皮膚老化過程。這一新型皮膚芯片老化模型的應用，有助于揭示老化新機制，對開發(fā)抗老化化妝品具有重要應用價值。
美白功效評估
圖11 皮膚衰老模型培養(yǎng)過程：使用機械刺激驅(qū)動系統(tǒng)進行周期性壓縮刺激12 h，并在非刺激狀態(tài)下保持12 h
皮膚是保護人體免受紫外線輻射（UVR）的重要器官。黑色素的過度表達可導致黃褐斑等疾病。色素沉著已成為醫(yī)學領(lǐng)域的研究熱點，與此同時，出于對美麗和健康的考慮，美白化妝品對公眾越來越有吸引力。
Qiwei Li 等開發(fā)出一種自動化的仿生人體微生理系統(tǒng)（MPS），該系統(tǒng)可用于構(gòu)建體外皮膚模型并提高仿生性能?；谌孜⒘骺氐谋砥ば酒‥oC）系統(tǒng)具有表皮屏障和仿黑色素功能，適用于膏狀和半固態(tài)物質(zhì)，同時也允許長期培養(yǎng)和成像。系統(tǒng)中表皮層分化良好，包括基底層、棘層、顆粒層和角質(zhì)層，相應層中表皮標記物（例如角蛋白-10、角蛋白-14、角化蛋白、鱗狀蛋白）表達水平適當。該團隊使用此表皮芯片測試了一種化妝品的美白效果，通過表征與分析證明了化妝品在減少黑色素合成方面的功效。同時還使用該表皮芯片測試了四種化學物質(zhì)的刺激和滲透特性。結(jié)果證明，該仿生EoC系統(tǒng)可作為皮膚刺激、滲透性、化妝品評估和藥物安全測試的有用工具。
圖12 （a）三單元表皮芯片結(jié)構(gòu)圖；（b）化妝品美白測試后皮膚芯片光學圖片：（i）陰性對照，（ii） 陽性對照，（iii）試驗組，（iv）空白對照
皮膚芯片技術(shù)在化妝品安全和功效性評估方面的應用，標志著體外測試方法的一大進步，這種方法通過模擬人體皮膚的關(guān)鍵特性和功能，為化妝品安全性和功效性評估提供了一種高效、精確且符合倫理的新方法。不僅有助于提高產(chǎn)品質(zhì)量和安全性，還推動了化妝品測試領(lǐng)域向更科學和人性化的方向發(fā)展。相信在未來，微流控皮膚芯片作為一種高度模擬人體皮膚結(jié)構(gòu)和功能的先進技術(shù)，會擁有更廣闊的發(fā)展前景。
參考文獻：
- 賀雨欣,文武龍,張煒燁,等.皮膚芯片的研究進展及應用[J/OL].中國醫(yī)院藥學雜志,1-7[2024-11-18].http://kns.cnki.net/kcms/detail/42.1204.R.20240709.1922.012.html.
- 胡陽陽,羅華菲.微流控芯片應用于皮膚領(lǐng)域研究的創(chuàng)新探索[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2024,55(05):593-603.DOI:10.16522/j.cnki.cjph.2024.05.001.
- 林鈮,羅飛亞,張鳳蘭,等.皮膚類器官與皮膚芯片在藥品及化妝品原料毒性測試中的應用進展[J].藥物評價研究,2023,46(10):2262-2269.
- 葉潔忺,張靜,張子霖,等.微流控技術(shù)在化妝品安全與功效評價中的應用[J].中國化妝品,2023,(03):104-108.
- Ágnes B ,Dorottya K ,Orsolya B , et al.Verification of P-Glycoprotein Function at the Dermal Barrier in Diffusion Cells and Dynamic “Skin-On-A-Chip” Microfluidic Device[J].Pharmaceutics,2020,12(9):804-804.
- Jing Z ,Zaozao C ,Yaoyao Z , et al.Construction of a high fidelity epidermis-on-a-chip for scalable in vitro irritation evaluation.[J].Lab on a chip,2021,21(19):3804-3818.
- Kim K ,Jeon M H ,Choi C K , et al.Testing the Effectiveness of Curcuma longa Leaf Extract on a Skin Equivalent Using a Pumpless Skin-on-a-Chip Model[J].International Journal of Molecular Sciences,2020,21(11):3898.
- Qiwei L ,Chunyan W ,Xiaoran L , et al.Epidermis-on-a-chip system to develop skin barrier and melanin mimicking model.[J].Journal of tissue engineering,2023,1420417314231168529-20417314231168529.
- Seung J L ,Jin K ,Baofang C , et al.Hybrid skin chips for toxicological evaluation of chemical drugs and cosmetic compounds.[J].Lab on a chip,2021,22(2):
- Subin J ,Jisue K ,Mi H J , et al.Development of an Aged Full-Thickness Skin Model Using Flexible Skin-on-a-Chip Subjected to Mechanical Stimulus Reflecting the Circadian Rhythm[J].International Journal of Molecular Sciences,2021,22(23):12788-12788.
- Zhengkun C ,Sina K ,Albert G , et al.Microfluidic arrays of dermal spheroids: a screening platform for active ingredients of skincare products.[J].Lab on a chip,2021,21(20):3952-3962.
- Zsófia V ,Dorottya K ,Bese M N , et al.Skin-on-a-Chip Technology for Testing Transdermal Drug Delivery—Starting Points and Recent Developments[J].Pharmaceutics,2021,13(11):1852-1852.
聯(lián)系我們
快速導航
關(guān)注我們